Obsah
Úvod
Štruktúra a replikácia DNK
Operácie s DNK
Metóda molekulárneho klonovania a polymerázná reťazová reakcia
Experiment L. Adlemana
Linky
O tejto kapitole



Ostatné kapitoly
Freemanove K modely
Umelé imunitné systémy
Biomimicry - Biomimetics
Umelé chémie
Chemické vlny
DNK počítače
Artificial Music
Memetika
Artificial Life Games
Artificial Art
Väzenská dilema


Hlavne menu
 O nás
 Tutoriály
 Archiv


Metóda molekulárneho klonovania a polymerázná reťazová reakcia

Metóda molekulárneho klonovania vychádza z predpokladu, že bunka je schopná za určitých okolností replikovať cudzorodú DNA. Geneticky zmanipulovaný vektor sa musí dostať do hostiteľskej bunky, ktorá túto službu vykoná. Tieto procesy však prebiehajú za hranicami možností svetelného mikroskopu a preto sa na sledovanie ich priebehu používajú nepriame genetické metódy. Ako príklad si uvedieme molekulárne klonovanie pomocou umelého plazmidu pBR 322. Využíva sa skutočnosť, že restrikčné miesto, kde sa napája cudzorodá DNK, sa nachádza v géne na rezistenciu proti ampicilínu. Plazmid pBR 322 má však aj gén rezistencie proti tetracyklínu, ktorý zostane neporušený. Prakticky nie je možné zabezpečiť, aby všetky plazmidy obsahovali po génovej manipulácii cudzorodú rekombinantnú DNK. Ak vysejeme hostiteľské bakteriálne bunky na platňu s tetracyklínom, rozmnožia sa všetky baktérie, do ktorých prenikol vektor pBR 322, či už s rekombinantnou DNK, alebo bez nej. Ak neskôr takto vyselektované bunky prenesieme do prostredia s ampicilínom, rozmnožovať sa budú len bunky neobsahujúce rekombinantnú DNK, pretože plazmidy, ktoré do nich prenikli majú neporušený gén rezistencie proti ampicilínu. Dnes sa na selekciu baktérií obsahujúcich rekombinantnú DNK používajú skôr signálne gény, ktoré sa dajú ľahko (napr. farebne) detekovať. Kolónie buniek sa líšia farebne, svietia, alebo rastú na vybranom substráte.

Význam objavu polymeráznej reťazovej reakcie (angl. Polymerase Chain Reaction - PCR) je v genetike porovnávaný s významom objavu tlačiarenského lisu v renesancii. Technika PCR môže v priebehu niekoľkých minút-hodín znásobiť požadovanú DNK sekvenciu niekoľko stomiliónov krát. PCR je založená na termostabilnom enzýme Taq polymeráze, ktorý je schopný syntetizovať komplementárny reťazec k danému reťazcu DNK v zmesi obsahujúcej jednak samostatné DNK bázy, jednak oligonukleotidové DNK molekuly dlhé asi 20 báz. Oligonukleotidy hrajú úlohu iniciátorov a anglicky sa nazývajú primers. Iniciátory tvoria krátke reťazce DNK komplementárne ku opačným koncom protiľahlých reťazcov dvojzávitnice pôvodnej DNK. Celá zmes sa najprv zohreje aby sa od seba separovali lineárne reťazce v dvojzávitnici vzorovej DNK. Neskôr sa zmes ochladí a iniciátory sa naviažu na konce oddelených jednovláknových molekúl DNK. Potom sa pomocou Taq polymerázy syntetizujú komplementárne molekuly k oddeleným reťazcom vzorovej DNK, čím sme dostali dva identické dvojzávity zdrojovej DNK. Tento proces sa opakuje, pričom počet syntetizovaných dvojzávitových kópií vzorovej DNK rastie exponenciálne. Za jednu hodinu prebehne asi 20 PCR cyklov, pričom sa počet kópií zväčší asi 220krát.

Technika polymeráznej reťazovej reakcie (PCR)

Predchádzajúci obrázok ilustruje techniku polymeráznej reťazovej reakcie (PCR). Dvojzávitnicu vzorovej DNK a) zahriatím rozdelíme na dve komplementárne jednovlákonové molekuly DNK d) e). Po následnom ochladení sa iniciátory b) c) viažu na vlákna d) a e). Enzým Taq polymeráza dosyntetizuje príslušné komplementárne vlákna f) g), takže z pôvodnej dvojzávitnice DNA a) dostávame dve identické kópie h) i).

Hore
Kontakty:     webmaster     admin     chief
Valid HTML 4.01! Valid CSS!