Obsah
Úvod
Štruktúra a replikácia DNK
Operácie s DNK
Metóda molekulárneho klonovania a polymerázná reťazová reakcia
Experiment L. Adlemana
Linky
O tejto kapitole



Ostatné kapitoly
Freemanove K modely
Umelé imunitné systémy
Biomimicry - Biomimetics
Umelé chémie
Chemické vlny
DNK počítače
Artificial Music
Memetika
Artificial Life Games
Artificial Art
Väzenská dilema


Hlavne menu
 O nás
 Tutoriály
 Archiv


Operácie s DNK

Súčastná genetika venuje veľkú pozornosť mikroorganizmom a to predovšetkým baktériam a fágom. Ich veľkou prednosťou je rýchlosť reprodukcie.

Bakteriálna bunka má organizáciu živej hmoty typickú pre bunky všetkých organizmov. Je obalená bunkovou stenou a v cytoplazme sa nachádzajú dôležité organely (ako napríklad ribozómy uplatňujúce sa pri budovaní bielkovinových buniek na základe kódu DNK). Genetický systém baktérie je tvorený dlhým, kruhovito stočeným vláknom dvojzávitnice DNK, ktorá predstavuje bakteriálny chromozóm.

Bakteriofágy (bakteriálne vírusy) sú veľmi jednoduché systémy stojace na hranici medzi živou a neživou hmotou.Medzi najštudovanejšie fágy patria tzv. T fágy, ktoré majú hlavičku s bičíkom a napádajú baktérie Escherichia coli (E. coli) nachádzajúce sa v črevách človeka. T fág sa skladá z bielkovinového obalu tvoriaceho proteínový obal, v ktorom je uložená DNK fága. Infekcia bakteriálnych buniek prebieha tak, že fág nasadne bičíkom na bunkovú stenu baktérie, naruší ju a do vnútra baktérie vnikne fágová DNK. Fágová DNK sa v bakteriálnej bunke začne rozmnožovať. Z DNK fága sa za výdatnej pomoci enzymatického systému baktérie budujú bielkovinové časti tiel nových fágov.

Štúdiom baktérii sa ukázalo, že v baktériách existujú okrem chromozomálnej DNK aj iné geneticky autonómne systémy

  • plazmidy
  • transpozóny
  • replikóny

Plazmidy sa dokážu samé replikovať nezávisle na replikácii bakteriálneho chromozómu. Plazmidové DNK sú dôležité pre prežitie baktérií, ak sa tieto dostanú do prostredia, proti ktorému plazmidy kódujú výrobu účinných ochranných látok.

Transpozóny. Ide o elementy DNK, ktoré sa od bakteriálneho chromozómu odpájajú a pripájajú na rozličných pozíciách. Ich konce sú k sebe pripútané viazaním komplementárnych báz a voľná časť transpozónu nesie samotný funkčný putujúci gén.

replikóny sú úseky DNK schopné samostatnej replikácie.

Obrovský význam autonómnych genetických systémov v baktériách spočíva v možnosti prenosu genetickej informácie nielen v rámci jednotlivých druhov mikroorganizmov, ale aj v rámci nepríbuzných rodov. Tak sa môže stať, že sa R plazmid z vcelku nevinnej bunky baktérie E. coli dostane do nejakej vysokopatogénnej baktérie.

Zásadný objav, ktorý umožnil človeku aktívne zasahovať do genetického materiálu mikroorganizmov bolo objavenie špecifických enzýmov - restrikčných endonukleáz. Fungujú ako nožnice pre strihanie molekúl DNK na špecifických pozíciách.

Do roku 1970 boli známe len enzýmy, ktoré buď štiepili nukleové kyseliny na veľké časti, alebo ich rozbíjali na jednotlivé nukleotidy. Restrikčné endonukleázy boli objavené pri štúdiu interakcie fágovej DNK s hostiteľskou bakteriálnou bunkou.

Restrikčné endonukleázy majú dôležitú vlastnosť, a to že štiepia DNK na rovnakých špecifických miestach. Po pôsobení restrikčnej endonukleázy jedného typu vznikajú vždy rovnaké konce rozštiepenej dvojzávitnice DNK. Napríklad endonukleáza EcoR I štiepi dvojzávit DNK v sekvencii GAATTG. Rozštiepeným kúskom DNK sa hovorí lepkavé konce (angl. sticky ends). Niektoré restrikčné endonukleázy, ako Hae III, rozstrihnú dvojzávit DNK priamo medzi dvojicami báz a vzniknú tzv. tupé konce. Restrikčné endonukleázy predstavujú prvý krok k získaniu presne definovaných malých úsekov DNK. Krátke molekuly DNK sa nazývajú aj oligonukleotidy.

Iný dôležitý enzým pre génovú manipuláciu je DNK ligáza. Tento enzým je schopný jednotlivé konce rozstrihnutej DNK opať spojiť. To umožňuje do rozstrihnutej kruhovej molekuly plazmidu vložiť kúsok cudzorodej DNK a kruh uzatvoriť. Iné ligázy sú schopné spájať "tupé" konce molekúl DNK. Takto sa na "tupé" konce môžu pripájať krátke umelo syntetizované úseky DNK, linkery, ktoré majú na druhom konci nukleotidové sekvencie vhodné na pripojenie k nejakej nosnej DNK. Pripravený úsek sa pomocou linkerov vsadí do molekuly DNK, ktorej "lepkavé" konce majú, vzhľadom na "lepkavé" konce linkerov, komplementárne sekvencie nukleotidov.

Jedným z najvážnejších problémov molekulárnej genetiky je doprava a integrácia cudzieho génu do genetického systému hostiteľskej bunky. Aby bolo možné úsek cudzej DNK v hostiteľskej bunke replikovať, je potrebné aby bol spojený so systémom, ktorý je schopný samostatnej replikácie. Už sme spomenuli, že takéto systémy sa nazývajú replikóny. Zvyčajne sa takýto proces popisuje ako spojenie cudzorodej DNK s vhodným vektorom, s ktorým sa spolu prenesie do hostiteľskej bunky. Vektor sa v hostiteľskej bunke samostatne rozmnožuje a vytvorí viacero kópií. Takýto proces sa nazýva molekulové klonovanie. Najvhodnejšími vektormi sú plazmidy, fágy a vírusy.

Nasledujúci obrázok ilustruje činnosť reštrikčného enzýmu EcoR I. Enzým “rozstrihne” dvojzávit DNK na miestach vyznačených šipkami, takže vzniknú dva voľné “lepkavé” konce.

Činnosť reštrikčného enzýmu EcoR

Hore
Kontakty:     webmaster     admin     chief
Valid HTML 4.01! Valid CSS!